蛋白質(zhì)分子的三維結(jié)構(gòu)是生命科學研究中極為重要的信息，X射線單晶衍射技術是目前獲得結(jié)構(gòu)信息最主要的手段，但如何篩選到第一個蛋白晶體是該技術必需的第一步，也是制約結(jié)構(gòu)生物學發(fā)展的主要瓶頸問題之一。現(xiàn)在一般通過規(guī)模篩選的方法從眾多的溶液中篩選出可結(jié)晶的條件，但是工作量較大，效率也不高。回顧了近年來在提高結(jié)晶篩選效率方向取得的成就，主要表現(xiàn)在2個方面：一是在傳統(tǒng)結(jié)晶方法和試劑基礎土發(fā)展起來的一系列新的高效的結(jié)晶技術和篩選試劑盒；二是從生物學、物理學和化學等角度提出的一些提高結(jié)晶篩選效率的新技術，主要包括通過分子工程改造蛋白、提高蛋白溶液的穩(wěn)定和均一性、導入籽晶、共結(jié)晶、改善結(jié)晶界面和變溫篩選等技術。最后展望了該領域未來的發(fā)展趨勢。
蛋白質(zhì)純化與結(jié)晶的原理
? ? ? ? 獲得蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)的第一個瓶頸，就是制備大量純化的蛋白質(zhì)(>10 mg)，其濃度通常在10 mg/ml 以上，并以此為基礎進行結(jié)晶條件的篩選。運用重組基因的技術，將特定基因以選殖(clone)的方式嵌入表現(xiàn)載體(expression vector)內(nèi)，此一載體通常具有易于調(diào)控的特性。之后再將帶有特定基因的載體送入可快速生長的菌體中，如大腸桿菌(Escherichia coli)，在菌體快速生長的同時，也大量生產(chǎn)表現(xiàn)載體上的基因所解譯出之蛋白質(zhì)。一般而言純度越高的蛋白質(zhì)比較有機會形成晶體，因此純化蛋白質(zhì)的步驟就成為一個重要的決定因素。
蛋白質(zhì)晶體的培養(yǎng)
? ? ? ? 在取得高純度的蛋白質(zhì)溶液后，接下來就是晶體的培養(yǎng)。蛋白質(zhì)晶體與其他化合物晶體的形成類似，是在飽和溶液中慢慢產(chǎn)生的，每一種蛋白質(zhì)養(yǎng)晶的條件皆有所差異，影響晶體形成的變量很多，包含化學上的變量，如酸堿度、沈淀劑種類、離子濃度、蛋白質(zhì)濃度等；物理上的變數(shù)，如溶液達成過飽和狀態(tài)的速率、溫度等；及生化上的變數(shù)，如蛋白質(zhì)所需的金屬離子或抑制劑、蛋白質(zhì)的聚合狀態(tài)、等電點等，皆是養(yǎng)晶時的測試條件。截至目前為止，并無一套理論可以預測結(jié)晶的條件，所以必須不斷測試各種養(yǎng)晶溶液的組合后，才可能得到一顆完美的單一晶體(圖一) 。
? ? ? ?理論告訴我們，最好的晶體生長要減少過飽和度到一個低的水平；維持高飽和度可能導致過多晶核的形成，從而產(chǎn)生很多小晶體（如圖1.1）。同時，晶體需要緩慢地生長以在表面達到一個最高的有序度。然而實際中，并沒有遵從這個基本規(guī)則。最簡單的改變過飽和度的方式是改變溫度或沉淀劑的濃度。
蛋白質(zhì)沉淀可以通過添加鹽、聚乙二醇或有機溶劑。作為沉淀劑，鹽有雙重作用，即鹽析和鹽溶。鹽離子屏蔽了蛋白質(zhì)分子表面的電荷，因此從而減弱了分子間的排斥力。此外，部分水被固定從而不可與蛋白質(zhì)結(jié)合，因為鹽離子周圍形成水化層。最常用的鹽是硫酸銨，其優(yōu)點是溶解性好，對大多數(shù)蛋白質(zhì)無損害，即使?jié)舛群芨摺?/p>
聚乙二醇對水有高親和性，能像鹽那樣固定水。而且，它以不同的方式影響蛋白質(zhì)的溶解度。PEG分子不能超過其半徑而更接近蛋白質(zhì)分子表面，蛋白質(zhì)分子周圍有PEG中心不能接近的水化層。如果蛋白質(zhì)分子聚集，這些水化層部分重疊，從而不可接近的區(qū)域變小。結(jié)果，可接近區(qū)域變大。從而有更多的空間對PEG分子可用，它們的熵增加（以一些蛋白質(zhì)熵為代價），系統(tǒng)的自由能降低。因此，蛋白質(zhì)分子聚集的這種情況在使用PEG時是最有利的。
蛋白質(zhì)結(jié)晶中最普遍的有機溶劑是MPD。有機溶劑具有靜電效應，它們能降低介質(zhì)的的介電常數(shù)。靜電力變強，從而壓縮蛋白質(zhì)分子周圍離子的雙電層。這些分子可以彼此更加接近，如果在一個有利的方向，它們便可以聚集。
一些蛋白質(zhì)在水中溶解度不好，但是如果加入少量鹽（比鹽析少的多）就可溶解。移除鹽后，蛋白質(zhì)便會析出。這種鹽溶效應可以解釋為蛋白質(zhì)分子表面帶電基團和溶液中離子相互競爭的結(jié)果。在有溶劑離子時，蛋白質(zhì)分子不會被離子雙層包圍，而能通過不同蛋白質(zhì)分子上異種電荷之間的庫侖力相互聚集。如果少量離子被加入，蛋白質(zhì)周圍會形成離子雙層，它們彼此之間不擴散不排斥。
其他降低蛋白質(zhì)溶解度的方法有改變?nèi)芤簆H或溫度。
綜上所述，通常結(jié)晶蛋白質(zhì)的步驟如下：
- 仔細檢測純度。
- a.慢慢增加沉淀劑的濃度，如PEG、鹽或有機溶劑等。
b.改變pH或溫度。
實際中，通常可用作結(jié)晶實驗的蛋白質(zhì)的量非常少。要確定最好的結(jié)晶條件，經(jīng)常需要進行大量的實驗。因此，每次實驗應該用最少量的蛋白質(zhì)。一個合理大小(0.2×0.2×0.2mm?=0.008mm3)的蛋白質(zhì)晶體重約10μg。因此，1mg純化的蛋白質(zhì)可以足夠做大約100次結(jié)晶實驗。
膜蛋白在水中不溶解，因此很難結(jié)晶。通常的策略是使用洗滌劑將其溶解于水溶液中，然后采用水溶性蛋白的操作程序(Michel,1990; Sowadski, 1994)。Landau和Rosenbusch（1996）引進一種新的方法能夠結(jié)晶膜蛋白。他們采用脂立方相作為各種化合物結(jié)晶的母體，脂立方相是具有立體對稱性的液晶，它們能在脂和水的混合物中形成(Lindblom and Rilfors, 1989)。一些類型的脂立方相是存在的。Landau等人（1997）成功地在某一類型脂立方相中生長出了高度有序的細菌視紫紅質(zhì)（bacteriorhodopsin）膜蛋白晶體(see also Gouaux, 1998)。但仍要看是否這種方法在結(jié)晶更多膜蛋白中取得成功。
? ? ? ? ?蛋白質(zhì)晶體的培養(yǎng)，通常是利用氣相擴散法(Vapor Diffusion Method) 的原理來達成；也就是將含有高濃度的蛋白質(zhì)(10-50 mg/ml)溶液加入適當?shù)娜軇档偷鞍踪|(zhì)的溶解度，使其接近自發(fā)性的沈淀狀態(tài)時，蛋白質(zhì)分子將在整齊的堆棧下形成晶體。舉例來說，我們將蛋白質(zhì)溶于低濃度(~1.0 M) 的硫酸銨溶液中，將它放置于一密閉含有高濃度(~2.0 M)硫酸銨溶液的容器中，由氣相平衡，可以緩慢提高蛋白質(zhì)溶液中硫酸銨的濃度，進而達成結(jié)晶的目的(圖二)。
? ? ? ?蛋白質(zhì)晶體在外觀上與其他晶體并無明顯不同之處，但在晶體的內(nèi)部，卻有很大的差異。一般而言，蛋白質(zhì)晶體除了蛋白質(zhì)分子外，其他的空間則充滿約40 %至60 %之間的水溶液，其液態(tài)的成分不僅使晶體易碎，也容易使蛋白質(zhì)分子在晶格排列上有不規(guī)則的情形出現(xiàn)，造成晶體處理時的困難及繞射數(shù)據(jù)上的搜集不易等缺點。但也由于高含水量的特性，讓蛋白質(zhì)分子在晶體內(nèi)與水溶液中的狀態(tài)，極為相似。所以由晶體所解出的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，基本上可視為自然狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)。
? ? ? ? ?蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的方法簡介 到目前為止，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的方法主要是兩種，x射線衍射和NMR。近年來還出現(xiàn)了一種新的方法，叫做Electron Microscopy。其中X射線的方法產(chǎn)生的更早，也更加的成熟，解析的數(shù)量也更多，我們知道，第一個解析的蛋白的結(jié)構(gòu)，就是用x晶體衍射的方法解析的。而NMR方法則是在90年代才成熟并發(fā)展起來的。這兩種方法各有優(yōu)點和缺點。
蛋白質(zhì)結(jié)晶原理（Principles of Protein Crystallization）
蛋白質(zhì)的X射線結(jié)構(gòu)分析首先要獲得合適的單晶。蛋白質(zhì)結(jié)晶學尚未發(fā)展成熟，盡管很受人親睞，特別是受航天飛機中微重力實驗(Kundrot et al., 2001; McPherson et al., 1995)的激發(fā)。蛋白質(zhì)結(jié)晶是一個反復試驗的過程，蛋白質(zhì)逐漸會從溶液中析出，雜質(zhì)、晶核及其他未知因素對此過程有所影響。通常，蛋白質(zhì)越純，生長晶體幾率越大。蛋白質(zhì)結(jié)晶學者對蛋白質(zhì)的純度要求要嚴于生化學家的要求，后者往往在酶催化活性足夠高時就很滿意。另一方面，為了使蛋白質(zhì)結(jié)晶，不僅要加其他成分，所有蛋白質(zhì)分子的表面性質(zhì)也必須是相同的，特別是表面的電荷分布，因為它影響晶體內(nèi)分子的聚集。質(zhì)譜是蛋白質(zhì)結(jié)晶中的一種有效工具，例如檢測重組蛋白的表達、樣品純度、重原子衍生物及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的特性(Cohen, 1996; Potier et al.,2000)。
蛋白質(zhì)結(jié)晶涉及四個重要步驟如下：
- 蛋白質(zhì)純度的確定。如果不夠非常純，必須要進一步純化。
- 蛋白質(zhì)溶解于合適的溶劑中，從中它能通過一種鹽或有機化合物而析出。溶劑通常是水-緩沖劑溶液，有時加有機溶劑，如2-甲基-2，4-戊二醇（MPD）。正常情況下，沉淀劑也被加入，但是濃度不高于使沉淀產(chǎn)生。對于不溶于水-緩沖劑或水-有機溶劑的膜蛋白，還需要加入去污劑。
- 使溶液過飽和。在這一步中，小聚集體形成，它是晶體生長所需的核。對小分子的結(jié)晶來說，相比于蛋白質(zhì)更為人熟知，晶核的自發(fā)形成需要提供表面張力能。一旦這個能障被突破了，晶體開始生長。能障在高水平的過飽和度時很容易克服。因此，在高過飽和度時，晶核更易自發(fā)形成。晶核的形成可作為一個過飽和度和其他參數(shù)的函數(shù)通過多種方法來研究，包括光散射、熒光去極化及電子顯微鏡。
- 一旦晶核形成，晶體生長正式開始。對低分子量的化合物而言，新分子會逐步結(jié)合到正在生長的晶體表面。這是由于這些位置的結(jié)合能比較大，相對于分子結(jié)合到平滑的表面。這些步驟要么由晶系缺陷造成，要么發(fā)生在表面隨機形成的晶核。
蛋白質(zhì)結(jié)晶方法大總結(jié)?
1.1結(jié)晶方法(Crystallization Techniques)
1.1.1 分批結(jié)晶(Batch Crystallization) 這是最老的最簡單的結(jié)晶方法，其原理是同步地在蛋白質(zhì)溶液中加入沉淀劑，立即使溶液達到一個高過飽和狀態(tài)。幸運的話，不需進一步處理即可在過飽和溶液中逐漸長出晶體。一個用于微分批結(jié)晶的自動化系統(tǒng)已被Chayen等人設計出（1991，1992），其微分批方法中，他們在1-2μl包含蛋白質(zhì)和沉淀劑的液滴中生長晶體。液滴被懸浮在油（如石蠟）中，油的作用是作為封層以防止蒸發(fā)，它并不干擾普通沉淀劑，但是干擾能溶解油的有機溶劑(Chayen, 1997; see also Chayen, 1998)。
1.1.2 液-液擴散(Liquid–Liquid Diffusion) 這種方法中，蛋白質(zhì)溶液和含有沉淀劑的溶液是彼此分層在一個有小孔的毛細管中，一個測熔點用的毛細管一般即可（如圖1.2）。下層是密度大的溶液，例如濃硫酸銨或PEG溶液。如果有機溶劑如MPD被用作沉淀劑，它會在上層。以1：1混合，沉淀劑的濃度應該是所期最終濃度的二倍。兩種溶液（各自約5μl）通過注射器針頭導入毛細管，先導入下層的。通過一個簡易的搖擺式離心機去除氣泡。再加入上層，進而兩層之間形成一個明顯的界面，它們會逐漸彼此擴散。 Garc′?a-Ruiz and Moreno（1994）已經(jīng)發(fā)展液-液擴散技術至針刺法。蛋白質(zhì)溶液通過毛細力被吸入狹窄的管中，管的一端是封閉的。接著，開放端被插入置于小容器的凝膠中，凝膠使得管豎直，蛋白質(zhì)溶液與凝膠接觸。含有沉淀劑的溶液被倒在凝膠上，整個裝置被保存于封閉的盒子以防蒸發(fā)。沉淀劑通過凝膠和毛細管的擴散時間可以由毛細管插入凝膠的深度控制，從而蛋白質(zhì)溶液中即可形成過飽和區(qū)域，毛細管底部高而頂部低。這也可作為一個篩選佳結(jié)晶條件的額外信息。
1.1.3 蒸氣擴散（Vapor Diffusion）
1.1.3.1 懸滴法（The Hanging Drop Method）這種方法中，在一個硅化的顯微鏡蓋玻片上通過混合3-10μl蛋白質(zhì)溶液和等量的沉淀劑溶液來制備液滴。蓋玻片置于一個盤子的凹槽之上，凹槽的一部分填有所需的沉淀劑溶液約1ml。在蓋玻片放好之前，小室的凹槽周圍用油或油脂密封（如圖3）。
1.1.3.2 沉滴法（The Sitting Drop Method）在懸滴法中，如果蛋白質(zhì)溶液表面張力很小就會在蓋玻片表面展開。此時，沉滴法更有利，圖4給出了沉滴法的簡圖。
1.1.4 透析法（Dialysis） 除了上述使得蛋白質(zhì)結(jié)晶的方法，還有許多透析技術。透析的優(yōu)點是沉淀溶液容易改變，對于適量的蛋白質(zhì)溶液（多于0.1ml），可用透析管完成（如圖1.5a）。透析膜通過橡皮圈連在管子上，但在使用前要用水大量漂洗或最好在水中煮約10min。對微升量的蛋白質(zhì)溶液而言，可以使用覆有透析膜的厚壁微毛細管（Zeppezauer method）或者樹脂玻璃紐扣（如圖1.5b）。紐扣的缺點是紐扣中的蛋白質(zhì)晶體不能通過極化顯微鏡觀察到。
另一中微透析方法在圖1.6中有描述，將5μl蛋白質(zhì)溶液注射到一個毛細管中，毛細管覆有透析膜，膜可用塑料管套緊。對蛋白質(zhì)溶液進行簡單離心，然后用鑄模粘土將毛細管封閉，接著將毛細管放入含有透析液的Eppendorf管中。